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快速無菌檢測全自動系統(tǒng)用于藥品快速無菌檢查的評價研究

更新時間：2022-04-23點擊次數(shù)：2256

BACTEC FX 全自動系統(tǒng)用于藥品快速無菌快速檢查的評價研究

上海市食品藥品檢驗所，國家藥品監(jiān)督管理局藥品微生物檢測技術重點實驗室，上海 201203


摘要：目的：評價 BACTEC FX 全自動系統(tǒng)用于無菌快速檢查的可行性。方法：選擇 15 種不同類型的無菌制劑，參照 2015 年版中國藥典四部藥品微生物檢驗替代方法驗證指導原則，以中國藥典無菌檢查法為參考，考察該方法的專屬性、檢測限、重復性的及耐用性。結果：專屬性試驗結果表明該系統(tǒng)適用于部分無菌制劑的無菌檢查，其中，對于丙泊在注射液，該系統(tǒng)的無菌檢查結果與藥典方法基本相當。結論：BACTEC FX 全自動系統(tǒng)用于藥品無菌檢查具有快速、靈敏度高的優(yōu)勢，有望為常規(guī)無菌檢查法帶來有效的補充。

關鍵詞：無菌檢查；CO2 檢測技術；快速檢測技術；BACTEC FX

Keywords: sterility test; CO2 detection technology; rapid microbiological method (RMM); BACTEC FX

無菌檢查法系用于檢查藥典要求無菌的藥品、生物制品、醫(yī)療器械、原料、輔料及其他品種是否無菌的一種方法[1]。無菌檢查法是最古老和成熟的微生物檢測方法之一。最早可追溯至 1932 年的英國藥典[2]，我國的第一部藥典（1953 年版）也收載了無菌檢查法。在此之后的藥典改版中，國內(nèi)外藥典對于無菌檢查法進行了多次修訂，目前各國藥典[3-5]基本協(xié)調(diào)統(tǒng)一，均采用培養(yǎng)基渾濁觀察法判斷產(chǎn)品的無菌狀況，培養(yǎng)周期一般不少于 14 天。該方法的適用性較強，但也有一些限制，較長的培養(yǎng)周期難以應對重大藥害事件對時間的緊迫需求；依靠培養(yǎng)基渾濁觀察法受操作人員經(jīng)驗影響較大，具有一定的主觀性，而且在整個檢查過程中需要反復觀察，操作繁瑣，自動化程度低，缺乏一定的可追溯性[6]。近年來，各國藥典和法規(guī)均鼓勵新技術應用于微生物領域，如聚合酶鏈式反應（PCR）技術[7]、三磷酸腺苷(ATP)發(fā)光檢測技術[8]、pH/CO2 電阻檢測[9-11]等，這些快速微生物檢測技術有效的提升了藥品微生物的檢出效率。

BACTEC FX 全自動系統(tǒng)是基于微生物生長原理，培養(yǎng)瓶內(nèi)的各種營養(yǎng)物質(zhì)可提供微生物生長的物質(zhì)基礎，而微生物生長過程中的代謝產(chǎn)物之一 CO2 將激活瓶內(nèi)底部熒光感應物質(zhì)而發(fā)出熒光，熒光信號變化與 CO2 變化成正比。儀器瓶位內(nèi)的探測器探測到該熒光信號的變化并經(jīng)一系列運算公式的運算，得出熒光信號變化的各種參數(shù)，從而判斷培養(yǎng)瓶內(nèi)是否有微生物生長。該系統(tǒng)目前在臨床領域應用較為廣泛[12]，也有用于無菌樣品的檢測的報道[13-14]。

本研究選擇了 15 種典型的無菌制劑，參照 2015 年及 2020 年版中國藥典四部通則<9201>藥品微生物檢驗替代方法驗證指導原則的有關內(nèi)容，對 BACTEC FX 全自動系統(tǒng)與中國藥典的無菌檢查法進行了系統(tǒng)比較。同時選取特定品種，全面評估 BACTEC FX 全自動系統(tǒng)與中國藥典的無菌檢查法在專屬性、檢測限、重復性以及耐用性是否存在差異。為該品種是否能采用 BACTEC FX 全自動系統(tǒng)進行無菌快速檢測提供依據(jù)。

1   儀器與材料

1.1  試驗儀器

BACTECTM FX40 全自動系統(tǒng)（美國，BD 公司）。

1.2  試驗菌株

金黃色葡萄球菌 CMCC(B)26003 、大腸埃希菌 CMCC(B)44102 、銅綠假單胞菌

CMCC(B)10104、生孢梭菌 CMCC(B)64941、枯草芽孢桿菌 CMCC(B)63501、白色念珠菌

CMCC(F)98001、黑曲霉 CMCC(F)98003 均購于中國醫(yī)學細菌菌種保藏管理中心(CMCC)。

1.3  試驗樣品

序號

樣品名稱

規(guī)格

1

碘海醇注射液

100ml

2

鹽酸氨溴索注射液

2   ml

3

門冬氨酸鉀鎂注射液

10   ml

4

丙泊注射液

20   ml

5

依托咪酯乳狀注射液

10   ml

6

ω-3 魚油脂肪乳注射液

100   ml

7

結構脂肪乳注射液

250   ml

8

注射用丁二磺酸腺苷蛋氨酸

5ml:5g

9

注射用還原型谷胱甘肽

0.6g

10

吡諾克辛滴眼液

5   ml

11

復方托吡卡胺滴眼液

10   ml

12

氟米龍滴眼液

5   ml

13

羧甲基纖維素鈉滴眼液

0.4 ml

14

吸入用丙酸倍氯米松混懸液

2   ml

15

注射用硫酸多黏菌素   B

50   萬單位

1.4  試驗用試劑及培養(yǎng)基

硫乙醇酸鹽液體培養(yǎng)基、胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基及胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基均購自北京三藥科技開發(fā)公司。

BACTECTM Standard/10 Aerobic/F 標準需氧瓶、BACTECTM Lytic/10 Anaerobic/F 含溶血素厭氧瓶及 BACTEC ™ PLUS+ Aerobic/F 樹脂需氧瓶均購于美國 BD 公司。

2        方法

2.1  無菌檢查

藥典組：按照 2015 年版中國藥典四部通則<1101>的規(guī)定，采用薄膜過濾法，接種硫乙醇酸鹽液體培養(yǎng)基置于 32.5℃，胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基置于 22.5℃培養(yǎng) 5d，每天觀察結果。

BACTEC FX 組（FX 組）：將一定量供試品和<100cfu 試驗菌加入標準需氧瓶或厭氧瓶中混勻，直接上機檢測，溫度設置 35℃，培養(yǎng)時間為 5d，機器自動運行發(fā)現(xiàn)陽性后判讀并報警。

比較藥典組和 FX 組的 5d 的生長情況。

2.2 丙泊注射液無菌快速檢查的評價

2.2.1   專屬性

專屬性試驗方法同 2.1，藥典組和 FX 組每種試驗菌平行進行三次獨立試驗。

2.2.2    檢測限

藥典組和 FX 組的樣品接種方法與專屬性相同，供試品中加入＜2cfu 的試驗菌，每種試驗菌重復進行 10 次。

2.2.3    重復性

由不同的實驗人員于不同的實驗時間，在不同的實驗室，按照專屬性方法取樣和接種， 進行重復性試驗，考察方法的精密度。

2.2.4    耐用性

增加樣品的接種量至 10ml、20ml 或延遲 24 上機，其他參考專屬性試驗不變，考察 FX

組方法的耐用性。

3   結果

3.1 無菌檢查

15 個試驗樣品的無菌檢查結果表明，藥典組和 FX 組的促生長能力基本相同，FX 組對 7 株試驗菌的促生長能力普遍快于藥典組（表 1 和表 2）；但是仍有 4 個品種：鹽酸氨溴索注射液、吡諾克辛滴眼液、復方托吡卡胺滴眼液和氟米龍滴眼液出現(xiàn)“假陰性"的結果。將接種量由 4ml 減少至 1ml，鹽酸氨溴索注射液能在規(guī)定時間內(nèi)報告陽性，而其余 3 種滴眼液仍未能消除“假陰性"（表 3）。進一步采用帶中和效果的樹脂瓶進行實驗，恢復 4ml 的接種量，四種樣品均在規(guī)定時間給出陽性結果（表 3）。

表 1 FX 組檢出時間(d/h/min)

Tab.1 Detection time of FX group(d/h/min)

序號(No

.)

樣品名稱

(sample)

大腸埃希氏菌(Escheric hia coli)

金黃色葡萄球菌(Staphylococ cus aureus)

生孢梭菌(Clostridi   um  sporogene s)

枯草芽孢桿菌(Bacillus   subtilis)

白色念珠菌(Candid a     albicans

)

黑曲霉(Aspergill us   niger)

銅綠假單胞菌(Pseudomo nas  aeruginosa)

1

碘海醇注射液

(Iohexol injection)

0:08:28

0:13:06

0:11:37

0:09:15

0:14:18

1:23:45

0:15:08

2

鹽酸氨溴索注射液(Ambroxol   Hydrochloride

Injection)

-

0:20:12

0:06:57

5:06:38

0:15:17

-

0:16:44

3

門冬氨酸鉀鎂注射液 （Potassium   magnesium aspartate

injection）

0:08:27

0:14:13

0:12:07

0:09:54

0:14:46

2:02:04

0:15:34

4

丙泊注射液

（Propofol   injection）

0:08:36

0:13:48

0:10:35

0:09:43

0:13:54

2:13:33

0:15:04

5

依托咪酯乳狀注射液（Etomidate

emulsion   injection）

0:08:16

0:12:27

0:12:55

0:09:02

0:13:54

3:12:53

0:15:34

6

ω-3 魚油脂肪乳注射

液（ω-3 Fish Oil Fat Emulsion   Injection）

0:08:25

0:12:27

0:10:35

0:09:42

0:14:03

3:12:53

0:15:37

7

結構脂肪乳注射液

（Structural Fat Emulsion Injection）

0:08:25

0:12:17

0:10:34

0:09:32

0:13:43

1:23:24

0:15:37


  

8

注射用丁二磺酸腺苷蛋氨酸

（Ademetionine 1,4 - Butanedisulfonate for

Injection）

1:01:13

0:21:06

4:07:04

0:14:11

0:15:42

2:02:12

0:18:47

9

注射用還原型谷胱甘肽

（Reduced Glutathione For

Injection ）

0:08:15

0:16:55

0:10:44

0:11:01

0:16:13

2:12:52

0:17:04

10

吡諾克辛滴眼液

（Pirenoxine Ophthalmic

Solution）

0:08:17

-

0:12:17

-

0:14:25

-

0:15:54

11

復方托吡卡胺滴眼液 （Compound   Tropicamide Eye

Drops）

0:20:37

-

-

-

1:04:41

-

0:17:04

12

氟米龍滴眼液

（Fluorometholone Eye Drops）

0:08:26

-

0:11:06

-

0:14:14

-

0:15:45

13

羧甲基纖維素鈉滴眼液

（Carboxymethylcell ulose   Sodium Eye

Drops）

0:08:26

0:12:38

0:13:15

0:09:53

0:14:14

1:18:43

0:16:05

14

吸入用丙酸倍氯米松混懸液

（Beclomethasone dipropionate inhalation

suspension）

0:08:15

0:13:36

0:11:04

0:09:22

0:13:43

2:12:42

0:15:36

15

陰性對照

(Negative   Control)

-

-

-

-

-

-

-

16

陽性對照

(Positive Control)

0:08:03

0:12:33

0:10:23

0:09:11

0:14:10

1:14:38

0:15:04

注：“-"表示培養(yǎng) 5 天仍未報陽性結果。

Note:"-"means that no positive results have been reported after 5 days.

表 2  藥典組檢出時間(d)

Tab.2 Detection time of pharmacopoeia group(d)

序號

(No.)

樣品名稱

(sample)

大腸埃希氏菌   (Escherichia

coli)

金黃色葡萄球菌    (Staphylococcus

aureus)

生孢梭菌(Clostridium sporogenes)

枯草芽孢桿菌   (Bacillus

subtilis)

白色念珠菌  (Candida

albicans)

黑曲霉(Aspergillus niger)

銅綠假單胞   菌    (Pseudomonas

aeruginosa)

1

碘海醇注射液

(Iohexol injection)

1

1

1

2

2

2

2

2

鹽酸氨溴索注射液

(Ambroxol Hydrochloride   Injection)

1

1

1

2

2

2

2

3

門冬氨酸鉀鎂注射液

（Potassium magnesium aspartate injection）

1

1

1

2

2

2

2

4

丙泊注射液

（Propofol injection）

1

1

1

2

2

2

2

5

依托咪酯乳狀注射液

（Etomidate emulsion injection）

1

1

1

2

2

2

2

6

ω-3 魚油脂肪乳注射液

（ω-3 Fish Oil Fat Emulsion   Injection）

1

1

1

2

2

2

2


  

7

結構脂肪乳注射液

（Structural Fat Emulsion Injection）

1

1

1

2

2

2

2

8

注射用丁二磺酸腺苷蛋氨酸

（Ademetionine 1,4 - Butanedisulfonate for

Injection）

1

1

1

2

2

2

2

9

注射用還原型谷胱甘肽

（Reduced Glutathione For Injection ）

1

1

1

2

2

2

2

10

吡諾克辛滴眼液

（Pirenoxine Ophthalmic Solution）

1

1

1

2

2

2

2

11

復方托吡卡胺滴眼液

（Compound Tropicamide Eye Drops）

1

1

1

2

2

2

2

12

氟米龍滴眼液

（Fluorometholone Eye Drops）

1

1

1

2

2

2

2

13

羧甲基纖維素鈉滴眼液

（Carboxymethylcellulose Sodium Eye Drops）

1

1

1

2

2

2

2

14

吸入用丙酸倍氯米松混懸液（Beclomethasone   dipropionate inhalation

suspension）

1

1

1

2

2

2

2

15

陰性對照

(Negative   Control)

-

-

-

-

-

-

-

16

陽性對照

(Positive Control)

1

1

1

2

2

2

2

注：“-"表示培養(yǎng) 5 天仍未報陽性結果。

Note:"-"means that no positive results have been reported after 5 days

表 3 FX 組減少接種量或采用樹脂瓶檢出時間(d/h/min)

Tab.3 Detection time of FX group after reducing inoculation volume or changing to BACTEC ™ PLUS+ Aerobic/F medium(d/h/min)

樣品名稱

(sample)

培養(yǎng)瓶(culture medium)

接種量

(   inoculation volume)

（ml）

大腸埃希氏菌   (Escherichia

coli)

金黃色葡萄球菌    (Staphylococcus

aureus)

生孢梭菌(Clostridium   sporogenes)

枯草芽孢桿菌(Bacillus

subtilis)

黑曲霉(Aspergillus   niger)

鹽酸氨溴索注射液

(Ambroxol

Hydrochloride Injection)

標   準 瓶

(Standard)

1

00:08:23

/

/

/

1:23:23


4

00:10:15

/

/

/

01:09:47

樹 脂 瓶

(PLUS+)







吡諾克辛滴眼液

（Pirenoxine Ophthalmic

Solution）

標   準 瓶

(Standard)

1

/

-

/

-

-

樹   脂 瓶

(PLUS+)

4

/

01:01:44

/

01:15:15

01:10:17

復 方 托 吡 卡 胺滴眼液（ Compound Tropicamide Eye

Drops）

標   準 瓶

(Standard)

1

/

-

00:18:34

-

-

樹   脂 瓶

(PLUS+)

4

/

02:03:36

/

01:15:15

01:16:46

氟米龍滴眼液

（Fluorometholone Eye Drops）

標   準 瓶

(Standard)

1

/

-

/

-

-

樹   脂 瓶

(PLUS+)

4

/

00:16:34

/

00:13:05

01:10:16

注：“-"表示培養(yǎng) 5 天仍未報陽性結果，“/"表示未進行試驗。

Note:"-"means that no positive results have been reported after 5 days,"/" means no t tested.


  

3.3 丙泊注射液無菌快速檢查的評價

3.3.1   專屬性試驗結果 按照 2015 年版中國藥典無菌檢查的規(guī)定，丙泊在注射液在藥典組和 FX 組的添加的 7 株菌在 5 天內(nèi)均能正常生長，2 種方法的專屬性不存在差異。

3.3.2   檢測限試驗結果  采用 SPSSV13.0 fisher 確切概率法，對上述 7 株試驗菌的檢測限試驗結果分別進行統(tǒng)計分析（表 4）， 2 種方法的檢測限差異無顯著性差異。

表 4 丙泊注射液檢測限試驗結果

Tab.3 Results of detection limit of propofol injection.

試驗平

行

大腸埃希氏菌

(Escherichia   coli)

金黃色葡萄球菌    (Staphylococcus

aureus)

白色念珠菌(Candida   albicans)

枯草芽孢桿菌

(Bacillus subtilis)

黑曲霉(Aspergillus niger)

生孢梭菌(Clostridium   sporogenes)

銅綠假單胞菌(Pseudomonas   aeruginosa)


(N

藥典組   FX

藥典組  FX

藥典組  FX

藥典組  FX 組/h

藥典組  FX

藥典組  FX

藥典組   FX


o.)

（Chp）   組 /h

（Chp）   組 /h

（Chp）   組 /h

（Chp）

（Chp）   組 /h

（Chp）   組 /h

（Chp）   組 /h



/d

/d

/d

/d

/d

/d

/d


1

1              11.5

2               17.5

2               30

2               11.5

2               93.5

1               17

1              18.5


2

1              11.5

2               17.5

2               30

2               11.5

3               93.5

2               18

1              19.5


3

1              11.5

2               17.5

2               31.5

2               13

3               94

-                18

1              19.5


4

2              11.5

3               18.5

2               31.5

2               13

3               98.5

-                18.5

2              20


5

2              12

-                -

2               31.5

2               13.5

3               -

-                -

2              -


6

2              12.5

-                -

2               32.5

2               14

3               -

-                -

-               -


7

2              13.5

-                -

-                33

3               -

4               -

-                -

-               -


8

-               19

-                -

-                37

-                -

-                -

-                -

-               -


9

-               21

-                -

-                -

-                -

-                -

-                -

-               -


10

-               -

-                -

-                -

-                -

-                -

-                -

-               -


注：“-"表示培養(yǎng) 5 天仍未報陽性結果。

Note:"-"means that no positive results have been reported after 5 days

  重復性試驗結果  在 5d 內(nèi)，2 種方法的 7 株試驗菌均正常生長， FX 組的重復性與藥典組相當。

耐用性試驗結果  FX 組在接種量、上機時間發(fā)生變化的情況下，7 株試驗菌均能在 5d 內(nèi)被檢出，檢查結果不受影響，方法可正常使用。

4   討論


   本研究選擇了無菌制劑的代表劑型，包括注射劑和滴眼劑等，涵蓋了液體制劑和固體制劑，規(guī)格不等，選擇的樣品數(shù)量較多，同時，增加了銅綠假單胞菌作為試驗菌株，未見同類報道。由于 BACTEC FX 全自動系統(tǒng)的檢驗原理與直接檢查法基本相同，因此選擇的樣品大多為無抑菌性的樣品。試驗結果表明，BACTEC FX 系統(tǒng)并非適用于所有品種。以滴眼劑為例，3 種多劑量的滴眼液出現(xiàn)假陰性結果，而一次性使用的滴眼液未見異常，推測可能是多劑量的滴眼液中的防腐劑對結果造成了干擾。由于 BACTECFX 系統(tǒng)采用的是直接接種法，全組份均在培養(yǎng)基中，而藥典方法為薄膜過濾法，推測原輔料被濾過，對結果影響較小。

  為了消除樣品中可能存在的抑菌成分的影響，我們選擇了具有特殊吸附性的樹脂需氧瓶，該培養(yǎng)瓶由“帶正電荷樹脂"和“多價吸附樹脂"組成，可全面吸附多種抑菌成分，樹脂孔徑也為微生物的生長提供了附著表面，更有利于微生物生長。可以在不改變接種量的基礎上，獲得準確的結果。采用標準需氧瓶結果為陰性的 4 個樣品在采用樹脂瓶后，結果均為陽性。同時，我們也采用樹脂瓶對注射用硫酸多黏菌素 B 進行了人工污染實驗（結果未列出），除添加大腸埃希氏菌的培養(yǎng)瓶未能正常生長以外，其余 6  株菌均正常生長，提示樹脂瓶無法*中和此類抗生素的抑菌性。脂肪乳類無菌產(chǎn)品一直是無菌檢查中的一類難點，由于樣品本身的渾濁特性，在采用常規(guī)藥典方法進行無菌檢查時，供試品管易顯渾濁，通常需要在液體培養(yǎng)基培養(yǎng)到期后進 行二次轉(zhuǎn)接培養(yǎng)進行確認，這一操作不僅增加了污染的風險而且增加了無菌檢驗周期（大于 14 天）。而采用自動化的檢測系統(tǒng)可以克服這一缺陷。系統(tǒng)自動化采集生長信號，區(qū)別于傳統(tǒng)無菌檢查的繁瑣操作、靜態(tài)培養(yǎng)以及人為的濁度判讀法，降低了無菌操作的風險， 具有結果報告的實時性、可追溯性以及避免人為干擾的優(yōu)勢。本研究從專屬性、檢測限、重復性、耐用性 4 個方面對丙泊注射液無菌快速檢查方法和藥典方法進行了比較研究。結果表明，快速方法與藥典方法基本相當。采用 BACTEC FX 全自動系統(tǒng)能有效縮短產(chǎn)品陽性檢出時間。當然，該系統(tǒng)也有一定的局限性，如樣品的接種量有限。在本研究中，我們適當?shù)脑黾恿藰悠返慕臃N體積，均能準確的給出陽性結果。對于體積較大的注射液，可通過增加接種培養(yǎng)瓶的數(shù)量以滿足檢驗要求。另外，本研究的試驗不可能覆蓋所有的微生物，不能排除對于某些微生物的促生長能力 2 種方法可能不相同。在下一步研究中，需要增加試驗菌株的種類，特別是產(chǎn)品生產(chǎn)環(huán)境微生物的考察。

   綜上，選擇 BACTEC FX 全自動系統(tǒng)的作為藥品無菌快速檢查方法時，首先應考察樣品的特性，其次根據(jù)快速檢測方法及樣品的特點增加相應的菌株進行全面的評價。應用BACTEC FX 全自動系統(tǒng)作為無菌快速檢測方法，可為常規(guī)無菌檢查法帶來有效的補充。

參考文獻

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注：摘引上海藥檢所文章關于FX40在快速無菌領域的應用。

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